Análisis metabolómico sérico para la detección del daño hepático preneoplásico en personas con fragilidad aumentada por la edad

Introducción

El proyecto individual "Análisis metabolómico sérico para la detección del daño hepático preneoplásico en personas con fragilidad aumentada por la edad” tiene como objetivo validar los resultados obtenidos en un estudio reciente realizado en un número reducido de pacientes con tumores hepáticos (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30325540) para confirmar la capacidad diagnóstica de un grupo de metabolitos seleccionados. 

Con la edad avanzada es más frecuente que aparezcan enfermedades hepáticas graves como consecuencia de la exposición, en mayor o menor medida a lo largo de la vida, a distintos tipos de agentes (alcohol, virus, medicamentos, dietas ricas en grasas y/o azúcares). El hígado tiene una alta capacidad de regeneración cuando sufre un daño pero, cuando sucede de forma prolongada en el tiempo, se produce una inflamación crónica del tejido, que se considera un factor de riesgo para el desarrollo de tumores hepáticos. Además, hay que tener en cuenta que el hígado va siendo más sensible a las distintas agresiones en personas mayores.

El carcinoma hepatocelular (HCC), que se desarrolla en los hepatocitos, es el cáncer hepático más frecuente, mientras que el colangiocarcinoma (CCA), que se desarrolla en las células que forman los conductos que transportan la bilis desde el hígado hasta el intestino, es más raro, pero es un tipo de tumor muy agresivo, cuya incidencia ha aumentado en los últimos años en los países occidentales. El HCC se desarrolla en un 90-95% de los casos en hígados cirróticos por enfermedad alcohólica o hepatitis víricas, mientras que el CCA puede desarrollarse en sujetos con cirrosis, con hígado graso no alcohólico, con hepatopatías asociadas a colestasis crónica, como la colangitis esclerosante primaria (PSC), y también en sujetos sin un daño hepático identificado.

Ambos tipos de tumores se caracterizan por presentar un desarrollo silencioso, que justifica que suelan diagnosticarse en estadios avanzados, cuando los pacientes no son candidatos a cirugía, que es la principal opción potencialmente curativa. Considerando ambos tipos de tumores hepáticos, el diagnóstico se produce mayoritariamente en personas mayores de 55 años. La figura 1 muestra los datos de incidencia registrados en Salamanca en los últimos 5 años con los pacientes distribuidos por grupos de edad al diagnóstico, que son similares a los descritos en el resto de España y en países europeos.

Figura 1. Incidencia de tumores hepáticos en Salamanca en los últimos 5 años distribuida por grupos de edad.

Cuando los pacientes presentan síntomas, éstos pueden ser similares en ambos tipos de tumores, por lo que se recurre a una combinación de pruebas radiológicas, bioquímicas y de anatomía patológica, así como al estudio de la historia clínica del paciente para realizar el diagnóstico. Aunque las técnicas radiológicas han mejorado mucho en los últimos años, no siempre proporcionan resultados concluyentes. Por otra parte, en algunas ocasiones la localización del tumor impide la obtención de una biopsia y los marcadores tumorales que se determinan en sangre para ayudar en el diagnóstico, la alfa-fetoproteína (AFP) para el HCC y el antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9) para el CCA, no son específicos. 

La obtención de un diagnóstico preciso es muy importante, ya que cada tipo de tumor requiere un tratamiento con fármacos específicos para que se obtengan resultados óptimos. Estos hechos justifican que se siga investigando para identificar marcadores específicos y sensibles, a ser posible mediante un análisis mínimamente invasivo en muestras de sangre, que permitan un diagnóstico definitivo de los pacientes para que puedan recibir el tratamiento más adecuado y también que permitan seguir la respuesta de los tumores durante el tratamiento.

Al contrario de los estudios que analizan el tejido tumoral, que suele obtenerse en el momento del diagnóstico del tumor, la sangre ofrece la posibilidad de medir marcadores que permitan seguir la evolución de la enfermedad. Las tecnologías ómicas de alto rendimiento son una alternativa novedosa para identificar marcadores útiles para el diagnóstico precoz y preciso del cáncer. Entre estas tecnologías, la metabolómica, o el análisis de metabolitos de bajo peso molecular (<1500 Da) en muestras biologicas tiene gran portencial

El hígado juega un papel esencial en una amplia variedad de procesos metabólicos que son críticos para el mantenimiento de la homeostasis del organismo. Se sabe que un daño en este órgano puede tener un reflejo en el suero, en términos de desequilibrio de los metabolitos en suero debido al escape de compuestos desde las células dañadas y/o desde las células tumorales con actividades metabólicas alteradas. Nuestra hipótesis es que el análisis de determinados metabolitos en suero puede ayudar a alcanzar un diagnóstico definitivo del tipo de tumor hepático.

Sujetos de estudio y metodología

Para llevar a cabo este estudio se utilizan muestras de suero de pacientes con diagnóstico confirmado por anatomía patológica de HCC, CCA, hígado graso en distintas etapas de la enfermedad, colangitis esclerosante primaria (PSC) y otras hepatopatías, con distintos rangos de edad (mayores de 65 años) y de sujetos sanos (control).

En la figura 2 se representa de forma esquemática las distintas etapas para realizar el análisis de metabolitos en suero mediante cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS/MS).

En primer lugar, las muestras se procesan con distintos solventes (metanol, o una mezcla de cloroformo y metanol) para extraer los metabolitos agrupados por familias con propiedades físico-químicas similares (aminoácidos, triglicéridos, esteroles, ácidos biliares, etc). Los distintos extractos se inyectan en el aparato de HPLC-MS/MS, que los separa obteniéndose picos correspondientes a cada compuesto. Tras un procesamiento de los datos se obtiene la concentración de cada metabolito en la muestra y, posteriormente, se realiza un análisis estadístico para determinar cuáles están alterados específicamente en cada patología y determinar su valor diagnóstico para cada tipo de patología.

Figura 2. Flujo de trabajo para la determinación del perfil metabolómico. (A) La extracción de metabolitos se realiza fraccionando las muestras en grupos de especies con propiedades físico-químicas similares, tras la adición de un estándar interno. (B) Se utilizan tres plataformas para obtener el perfil del metaboloma en suero mediante UHPLC-MS. (C) Pre-procesamiento de los datos generados de las áreas de los picos de los cromatogramas correspondientes a los metabolitos detectados en cada inyección. Se define un rango lineal de detección de cada metabolito identificado. Se realiza una normalización intra- e inter-lote gracias a la corrección con el estándar interno y el control de calibración. (D) Una vez normalizados los datos, se realizan análisis de datos multivariados y univariados. (E) Selección de los mejores biomarcadores candidatos para el diagnóstico de cada tipo de enfermedad. 

Si se identifican biomarcadores específicos y sensibles para el diagnóstico de los tumores hepáticos y que permitan discriminar entre HCC y CCA se podría hacer un seguimiento de personas mayores en grupos de riesgo para el desarrollo de estos tumores para detectarlos en etapas iniciales y mejorar sus posibilidades de curación. 

Referencias

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